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細(xì)胞生長(zhǎng)的檢查方法(二)

更新時(shí)間:2016-06-23      點(diǎn)擊次數(shù):3815

1.檢測(cè)細(xì)胞代謝活性

檢測(cè)細(xì)胞的代謝活性也可以反映細(xì)胞增殖的情況。在細(xì)胞增殖過(guò)程中乳酸脫氫酶的活性會(huì)增加,而活性的脫氫酶可以使得外源性的四唑鹽或者阿爾瑪藍(lán)(Alamar blue)還原成為帶有顏色還原產(chǎn)物。通過(guò)分光光度計(jì)或者酶標(biāo)儀來(lái)讀取含染料培養(yǎng)基的吸光度,從而衡量細(xì)胞的代謝活性,檢測(cè)細(xì)胞增殖的情況。

四種zui常見(jiàn)的四唑鹽是:MTT、XTT、MTS和WST1,其還原產(chǎn)物為甲瓚(formazan)。

(1)四甲基偶氮唑鹽法(MTT):MTT商品名為噻唑藍(lán),是一種黃色的染料。1983年Mosmann建立MTT比色法,用于檢測(cè)細(xì)胞存活和增殖。其原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶,甲瓚并沉積在細(xì)胞中,而死亡的細(xì)胞無(wú)此功能。二甲亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的甲瓚,用酶聯(lián)免疫分析儀測(cè)定其光吸收值,可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)量范圍內(nèi),MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。MTT可以用于所有細(xì)胞類型,但MTT在標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)基中是不溶的,而且其生成的甲瓚晶體需要溶解在DMSC)中。因此,MTT主要作為終點(diǎn)檢測(cè)方法。另外,有研究發(fā)現(xiàn)過(guò)氧化物會(huì)降低MTT測(cè)定的準(zhǔn)確度,抑制將近95%,的MTT與O2-的反應(yīng),MTT溶解產(chǎn)物甲瓚會(huì)吸附在納米纖維上,而致使檢測(cè)的結(jié)果呈現(xiàn)假陰性。

(2)二甲氧唑黃比色法(XTT):XTT是一種與MTT類似的四唑氮衍生物,可被活細(xì)胞還原形成水溶性的橘黃色的甲瓚產(chǎn)物,不形成顆粒,可直接用酶聯(lián)免疫分析儀檢測(cè)吸光度,故較MTT法更加快速、簡(jiǎn)便、敏感。

但XTT水溶液不穩(wěn)定,需要低溫保存,現(xiàn)配現(xiàn)用。由于XTT的代謝產(chǎn)物呈橘黃色,故培養(yǎng)體系中有些黃色代謝物和試劑可能會(huì)影響其檢測(cè)結(jié)果。與MTT一樣,過(guò)氧化物可抑制近95%的XTT與O2-的反應(yīng),故對(duì)XTT測(cè)定的準(zhǔn)確度有一定的影響。

(3)內(nèi)鹽法(MTS):MTS是一種新型的MTT類似物。MTs在偶聯(lián)劑PMS存在的條件下,可被活細(xì)胞線粒體中的多種脫氫酶還原成水溶性的有色甲瓚產(chǎn)物,其顏色深淺與活細(xì)胞數(shù)量在一定范圍內(nèi)呈高度相關(guān),可用酶標(biāo)儀檢測(cè)。它的優(yōu)點(diǎn)在于無(wú)放射性、快速、安全、方便、靈活及特異性強(qiáng),同時(shí)又克服了MTT、XTT的缺點(diǎn)。

(4)四唑單鈉鹽法(WST-1):WST-1是水溶性四唑鹽試劑,是一種類似于MTT的化合物,在電子耦合試劑存在的情況下,可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的甲瓚。細(xì)胞增殖越多越快,則顏色越深;細(xì)胞毒性越大,則顏色越淺。WST-1是MTT的一種升級(jí)替代產(chǎn)品,和MTT或其他MTT類似產(chǎn)品如XTT、MTS等相比有明顯的優(yōu)點(diǎn)。首先,MTT被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成的甲瓚不是水溶性的,需要由特定的溶解液來(lái)溶解:而WST-1和XTT、MTS產(chǎn)生的甲瓚都是水溶性的,可以省去后續(xù)的溶解步驟。其次,WST-1產(chǎn)生的甲瓚比XTT和MTS產(chǎn)生的甲瓚更易溶解。再次,WST-1比XTT和MTS更加穩(wěn)定,加入WST-1顯色后,可以在不同時(shí)間反復(fù)用酶標(biāo)儀讀板,使檢測(cè)時(shí)間更加靈活,實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加穩(wěn)定。另外,WST-1和MTT、XTT等相比,線性范圍更寬,靈敏度更高。

(5)Cell countjn譬kit-8(CCK-8):CCK-8試劑中含有WST-8。WST-8是近年新開(kāi)發(fā)的一種較WST-1更新的水溶性四唑鹽,檢測(cè)原理與WST-1類似,但較WST-1更穩(wěn)定,靈敏度更高,溶解性更強(qiáng),更易于保存。CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的靈敏度比MTT、XTT及MTS更高,尤其適合于懸浮細(xì)胞,高通量藥物篩選。CCK-8法細(xì)胞毒性低,細(xì)胞檢測(cè)后還可重復(fù)利用,具有更好的實(shí)用性,可替代MTT法,具有良好的應(yīng)用前景。

(6)阿爾瑪藍(lán)法:阿爾瑪藍(lán)檢測(cè)試劑為細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測(cè)提供了一種簡(jiǎn)便、快速、可靠、安全的方法。阿爾瑪藍(lán)在氧化狀態(tài)下呈現(xiàn)紫藍(lán)色無(wú)熒光性,而在還原狀態(tài)下轉(zhuǎn)變?yōu)槌史奂t或紅色熒光的還原產(chǎn)物,可以用普通分光光度計(jì)或熒光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè),吸光度和熒光強(qiáng)度與活性細(xì)胞數(shù)成正比。阿爾瑪藍(lán)對(duì)細(xì)胞無(wú)毒、無(wú)害,不影響細(xì)胞代謝、細(xì)胞因子分泌、抗體合成等,可以對(duì)同一批細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行連續(xù)觀察和進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

MTT可以用于所有細(xì)胞類型,但MTT在標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)基中是不溶的,而且其生成的甲瓚晶體需要溶解在DMSO中。因此,MTT主要作為終點(diǎn)檢測(cè)方法。其他三種鹽與阿爾瑪藍(lán)一樣,都是可溶且無(wú)毒的。它們可以作為連續(xù)監(jiān)控手段來(lái)跟蹤細(xì)胞增殖的動(dòng)態(tài)改變。其中XTT的效率較低,需要添加額外的因子。而WST-1更靈敏有效,與其他鹽相比能夠更快顯色。阿爾瑪藍(lán)的靈敏度也很高,只要微孔板的孔中有100個(gè)細(xì)胞它就能夠檢測(cè)到。四唑鹽和阿爾瑪藍(lán)氧化還原染料能夠用于多種儀器和高通量研究,非常方便。

2.檢測(cè)ATP含量

ATP是細(xì)胞能量的直接來(lái)源,細(xì)胞內(nèi)的ATP含量受到嚴(yán)格的調(diào)控,死亡細(xì)胞或即將死亡的細(xì)胞幾乎不舍ATP,在細(xì)胞溶解物或提取物中測(cè)得的ATP濃度與細(xì)胞數(shù)之間存在嚴(yán)格的線性關(guān)系。因此,檢測(cè)ATP也可以得到細(xì)胞增殖的信息。

ATP檢測(cè)可以用成色反應(yīng)、熒光、化學(xué)發(fā)光或同位素等方法實(shí)現(xiàn)。目前應(yīng)用zui廣的方法基于螢火蟲(chóng)熒光素酶(催化熒光素氧化,消耗ATP。如果有ATP存在,則熒光素就會(huì)發(fā)光,發(fā)光效率*,發(fā)光量與ATP含量呈很好的線性關(guān)系,可以反映細(xì)胞內(nèi)ATP的含量。

3.活細(xì)胞熒光標(biāo)記

羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(CFSE)是一種可穿透細(xì)胞膜的熒光染料,CFSE能夠輕易穿透細(xì)胞膜,在活細(xì)胞內(nèi)聚積并與胞內(nèi)蛋白共價(jià)結(jié)合,水解后的CFSE釋放出熒光物質(zhì),這些共價(jià)結(jié)合的熒光物分子很少?gòu)募?xì)胞內(nèi)脫落。CFSE標(biāo)記后的細(xì)胞用于體內(nèi)觀察可以長(zhǎng)達(dá)數(shù)周。當(dāng)細(xì)胞分裂時(shí),CFSE標(biāo)記熒光可平均分配至兩個(gè)子代細(xì)胞中,因此其熒光強(qiáng)度是親代細(xì)胞的一半。這樣,在一個(gè)增殖的細(xì)胞群體,各連續(xù)代細(xì)胞的熒光強(qiáng)度呈對(duì)數(shù)遞減,利用流式細(xì)胞儀在488nm激發(fā)光和熒光檢測(cè)通道可對(duì)其進(jìn)行分析。

4.增強(qiáng)標(biāo)記檢測(cè)

增殖細(xì)胞特異性地表達(dá)某些特定蛋白,利用特異性的單抗來(lái)識(shí)別這些增殖細(xì)胞。例如,在人體細(xì)胞中,Ki-67,PCNA等可以作為細(xì)胞增殖的標(biāo)志。但是,由于需要組織切片,這種方法無(wú)法進(jìn)行高通量分析。不過(guò)這一方法頗受癌癥研究者們的青睞,因?yàn)樗軌蛴脕?lái)檢測(cè)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的增殖。

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